Saturday, April 23, 2011

Pewarnaan Sederhana

TEKNIK PEWARNAAN MIKROORGANISME

A. PENDAHULUAN
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa
Pewarna asam dapat tejadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewrna negatif. Contoh pewarna asam misalnya : tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain. Pewarnaan basa bisa terjadi biasenyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya metilin biru, kristal violet, safranin dan lain-lain.
Teknik pewarnaan asam basa ini hanya menggunakan satu jenis senyawa pewarna, teknik ini disebut pewarna sederhana. Pewarnaan sederhana ini diperlukan untuk mengamati morfologi, baik bentukmaupun susunan sel. Teknik pewarnaan yang lain adalah pewarnaan diferensial, yang menggunakan senyawa pewarna yang lebih dari satu jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan bakteri misalnya, bakteri gram positif dan bakteri gram negatif atau bakteri tahan asam dan tidak tahan asam. Juga diperlukan untuk mengamati struktur bakteri seperti flagela, kapsula, spora dan nukleus.
Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang belkau yakni sebagai berikut:
mempersiapkan kaca obyek. Kaca obyek ini harus bersih dan bebas lemak, untuk membuat apusan dari bakteri yang diwarnai.
mempersiapkan apusan. Apusan yang baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan yang tipis.
Apusan ini dapat berasal dari biakan cair atau padat.
Biakan Cair. Suspensi sel sebanyak satu atau dua mata jarum inokulasi diletakkan pada kaca obyek. Lalu diapuskan pada kaca obyek selebar ... cm. Biarkan mengering diudaraata diatas api kecil dengan jarak 25 cm. Biakan Padat. Bakteri yang dikultur pada medium padat tidak dapat langsung dibuat apusan seperti dari biakan cair, tapi harus diencerkan dulu. Letakkan setetes air pada kaca obyek, lalu denganjarum inokulasi ambil bakteri dari biakan padat, letakkan pada tetesan air dan apusan. Biarkan mengering diudara.• Fiksasi dengan pemanasan. Apusan bakteri pada akaca obyek bila tidak diletakkan secara kuat, dapat terhapus pada waktu proses pewarnaan lebih lanjut. Proses peletakan apusan pada kaca obyek dapat dilakukan diantaranyadengan cara memanaskan diatas api.
B. DASAR TEORI
-pewarnaan gram
Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.
Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998).
Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat warna (Hadioetomo, 1990).
Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998).
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatka. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Irawan, 2008).
Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :
- Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar.
- Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme.
- Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa.

Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen mikroba untuk pemeriksaan mikroskopik adalah (Pelczar, 1986) :
- Penempatan olesan atau lapisan spesimen pada kaca objek.
- Fiksasi olesan pada kaca objek.
- Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial.
Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :
- Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi.
- Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
- Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
- Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui.
Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan memberikan reaksi kalu mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif ataupun negative. Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga kalau kita memberikan pewarnaan yang bermuatan positif ataupun negatif (Suriawiria, 1985).
Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif). Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005)).
Pewarnaan Negatif. Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam (Campbell dan Reece, 2005).
Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri. Berikut merupakan berbagai bentuk sel bakteri (Anonim, 2008):


Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Irawan, 2008).
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut (Irawan, 2008):
a. Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.
b. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.
Pewarnaan Endospora. Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas (Irawan, 2008).
Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (kedua-duanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora. Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya (Irawan, 2008):
C. TUJUAN
Mengamati dan membedakan struktur yang terdapat dalam sel bakteri dan juga untuk membedakan kelompok bakteri berdasarkan reaksinya terhadap warna yang sekaligus menunjukkan sifat bakteri tersebut.
D. ALAT dan BAHAN
• Kaca obye• Jarum Inokulasi
• Mikroskop
• Tissue
• Aquades steril
• Pewarna dasar : kristal violet
• Larutan pengikat warna dasar : Larutan Iodin
• Larutan pencuci warna dasar : Alkohol ... %
• Pewarna pembanding : Lar. Safranin
• Biakan murni bakteri
E. CARA KERJA
1. Sediakan kaca benda yang bersih, lalu lewatkan diatas nyala api bunsen
2. teteskan setetes aquades steril diatas kaca benda tersebut
3. secara aseptik ambilah inokulum bakteri yang akan diperksa, lalu letakkan diatas tetesan aquades itu, kemudian ratakan perlahan-lahan
4. ambil kaca benda yang tegak sehingga apusan menjadi tipis dan merata. Biarkan sampai kering
5. fiksasi dengan cara melewatkan apusan tersebut diatas nyala api dengan cepat
6. letakkan apusan diatas kawat penyangga yang berada diatas mangkuk pewarna. Lalu teteskan larutan kristal violet pada apusan dan biarkan selama 30-60 detik
7. cuci warna dasar dengan air mengalir, keringkan
8. teteskan larutan iodin pada apusan, biarkan selama 30-60 detik
9. cuci larutan iodin dengan air mengalir, keringkan
10. rendam atau basuh dengan alkohol ... % selama ... detik
11. teteskan larutan safranin, biarkan selama 30-60 detik
12. cuci dengan air mengalir, lalu keringkan
13. amati dengan mikroskop
14. gambar bentuk morfologi

Date Source : Sabtu, 01 Agustus 2009
Sorce : http://rustan-biologiofscience.blogspot.com/2009/08/teknik-pewarnaan-mikroorganisme.html

DAFTAR PUSTAKA


Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Erlangga. Jakarta.
Hadioetomo, R, S., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.
Irawan, 2008. Teknik Pewarnaan Mikroba. http://wordbiology.wordpress.com. Diakses pada hari Senin, 13 April 2008 pada pukul 19.00 WITA.
Pelczar, M. W., 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi 1. UI Press. Jakarta.
Suriawiria, U., 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.
Volk, W. A. dan Margareth F. W., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.

No comments:

Post a Comment

Comment here please ! Thanks :)

Google+ Badge